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本试剂盒是通过测量Caspase 9的活性而用于细胞凋亡检测的。Caspase 9是CED-3亚家族中的一员。活化的Caspase 9能切割下游caspases，例如caspase-3,-6和-7，起始Caspase级联反应。在正常发育的中枢神经系统中，活化的Caspase 9是凋亡所必需的。

Caspase 9具有底物的选择性，其识别底物基序为Leu-Glu-His-Asp (LEHD)。本试剂盒利用Ac-LEHD-AMC作为荧光指示器来检测caspas-9的活性。通过caspas-9的切割AMC产生强蓝色荧光，其发射光在450nm和460nm之间，激发光为350nm和370nm之间。这种特性使得试剂盒能适合于DAPI滤光器。本试剂盒提供所有必需组分。该实验稳定、快速且适应高通量筛选的需求。它不仅能够定量凋亡细胞中caspas-9的活性还能筛选caspas-9的抑制剂。很多实验室利用本试剂盒进行高通量抑制剂的筛选。

组分	规格
组分A:Caspase 9 Substrate(200X)	2×50μL
组分B:Assay Buffer	20mL

保存：-20℃，干燥避光


最佳的细胞凋亡诱导条件，根据细胞类型、细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素而决定。

• 准备细胞：
  
  • 贴壁细胞：对于96孔板，每孔接种90μL 20,000个细胞；对384孔板，每孔接种20μL 5,000个细胞；过夜培养备用。
    
  • 悬浮细胞：离心收集细胞，并重悬细胞，对于用多聚D-赖氨酸包被过的96孔板，每孔接种90μL 20,000个细胞；对用多聚D-赖氨384孔板，每孔接种20μL 5,000个细胞；800rpm，2min，离心，备用。
• 准备caspase 9检测缓冲液：
  
  • Caspase 9 Substrate (组分A)和Assay Buffer (组分B)保存在-20℃，需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。
  • 使用前该试剂盒需要在室温解冻。
    
  • caspase 9检测缓冲液的制备：将50μL Caspase 9 Substrate (组分A)加入10mL Assay Buffer (组分B)，混匀；
• 检测方法：
  
  • 样品处理组：对于96孔板中，待检药物用PBS或配制所需缓冲液配制成10X待检药物溶液，每孔加入10μL待检测药物；对于384孔板中，待检药物用PBS或配制所需缓冲液配制成5X待检药物溶液，每孔加入5μL待检测药物；空白对照组（没有细胞的培养基）：加入相应体积的药物配制所需缓冲液；
    
  • 37℃，5% CO₂，培养箱中孵育细胞板达所需时间诱导细胞凋亡（用十字孢碱4～6小时诱导Jurkat细胞凋亡）；
    
  • 对于96孔板，每孔加入100μL caspase 9检测缓冲液；对于384孔板，每孔加入25μL caspase 9检测缓冲液（即2b步骤配制所得溶液）；
    
    • 如果需要，加入1μL 1mM Ac-DEVD-CHO caspase 9抑制剂到到样品中，10分钟后再加入caspase 9检测缓冲液，以抑制caspase 9样酶激活。
  • 加入caspase 9检测缓冲液后，避光室温孵育至少1小时；
    
  • 800rpm，2min，离心细胞板，悬浮细胞一定要离心；
    
  • 检测Ex/Em = 370/450nm处的荧光强度。

处理组测量的荧光强度值减去空白对照组测量的荧光强度值；空白对照组测量的荧光强度值受到培养液中生长因子或者细胞版的材质等影响。

图1.检测Jurkat细胞中Caspase9活性。将Jurkat细胞同时接种于一个96孔板中（Costar），80,000 cells/90μL/孔。用十字孢碱（终浓度为1μM）处理Jurkat细胞，未处理组作为空白对照，处理时间为5小时。每孔加入100μL caspase 9检测缓冲液，室温孵育1小时。使用FlexStation酶标仪(Molecular Devices)测量Ex/Em =370/450nm处的荧光强度。
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